RUANGAN LABORATORIUM KULTUR JARINGAN

Pertumbuhan eksplan dalam kultur jaringan diusahakan dalam lingkungan yang aseptik dan terkendali. Laboratorium yang efektif merupakan salah satu unsur penting yang ikut menentukan keberhasilan pekerjaan, baik untuk penelitian, mau-pun produksi. Laboratorium sebaiknya dibangun di daerah yang udaranya bersih, tidak banyak debu dan polutan. Bangunan laboratorium kultur jaringan sebaiknya mempunyai pembagian ruangan yang diatur sedemikian rupa sehingga tiap kegiatan terpisah satu dengan yang lainnya, tetapi mudah saling berhubungan dan mudah dicapai.

Pembagian ruangan laboratorium kultur jaringan berdasarkan kegiatan-kegiatannya adalah sebagai berikut :

1. Ruang persiapan/preparasi
2. Ruang transfer/tanam
3. Ruang kultur/inkubasi
4. Ruang stok/media jadi
5. Ruang timbang/bahan kimia

Ruang Persiapan

Ruang ini dipergunakan untuk mempersiapkan media kultur dan bahan tanaman yang akan dipergunakan, sebagai tempat mencuci alat-alat laboratorium, dan tempat untuk menyimpan alat-alat gelas. Sesuai dengan fungsinya, maka di-ruangan ini terdiri dari :

1. Hot plate dengan magnetic stirer
2. Oven
3. Pengukur pH, dapat berupa pH meter, atau kertas pH indikator
4. Autoklaf
5. Kompor gas
6. Tempat cuci
7. Labu takar, gelas piala, erlenmeyer, pengaduk gelas, spatula, petridish, pipet, botol kultur, pisau scapel.

Ruang Transfer/Tanam

Ruang transfer merupakan ruang di mana pekerjaan aseptik dilakukan. Dalam ruangan ini dilakukan kegiatan isolasi tanaman, sterilisasi dan penanaman eksplan dalam media. Ruangan ini sedapat mungkin bebas dari debu dan hewan kecil, serta terpisah dan tersekat dengan ruangan lain. Penggunaan AC sangat dianjurkan dalam ruangan ini. Ruang transfer dilengkapi peralatan sebagai berikut :

1. Laminar air flow cabinet, bisa juga enkas
2. Alat-alat diseksi; pisau bedah/scapel, pinset, spatula, dan gunting.
3. Hand sprayer yang berisi alkohol 70 %
4. Lampu bunsen

Ruang Kultur/Inkubasi

Merupakan ruang yang paling besar dibanding dengan ruangan yang lain. Ruangan ini harus dijaga kebersihannya dan sedapat mungkin dihindari terlalu banyak keluar masuknya orang-orang yang tidak berkepentingan. Ruangan ini berisi rak-rak kultur yang berfungsi untuk menampung botol-botol kultur yang berisi tanaman. Rak ini juga dilengkapi dengan lampu-lampu sebagai sumber cahaya bagi tanaman kultur. Selain rak kultur, ruang kultur juga harus dilengkapi dengan AC, pengukur suhu dan kelembapan, serta timer yang digunakan untuk menghidup-kan dan mematikan lampu secara otomatis.

Cahaya yang digunakan sebagai penerangan, sebaiknya cahaya putih yang dihasilkan dari lampu flourescent. Lampu flourescent dipakai karena sangat baik dan sangat efisien dalam penggunaan energi bila dibanding dengan lampu pijar. Karena pada lampu pijar, hampir 90 % merupakan energi panas, sehingga mem-pengaruhi ruangan.

Intensitas cahaya yang baik dari lampu flourescent adalah antara 100 – 400 ftc (1000 – 4000 lux). Intensitas cahaya dapat diatur dengan menempatkan jumlah lampu dengan kekuatan tertentu.

Lampu yang digunakan bisa berupa lampu TL dengan daya 15 watt atau 40 watt, tergantung panjang rak yang dibuat. Jarak antar rak 30 – 35 cm. Sebaiknya travo pada lampu TL dipasang terpisah dari box, (lebih baik kalau dipasang di luar ruang kultur), karena dapat membakar tanaman kultur dan membuat suhu ruang menjadi panas.

Selain lampu TL, lampu SL juga dapat dipakai. Pemakaian lampu ini dapat meng-hemat biaya listrik, juga lebih terang. Tinggi rak yang dibuat antara 50 – 60 cm. Dalam satu bidang rak dapat memakai 2 atau 3 lampu SL daya 5 – 10 watt tergantung ukuran panjang rak.

Panjang penyinaran/lama penyinaran yang dibutuhkan oleh tiap tanaman berbeda-beda. Berapa lama penyinaran harus diberikan, tergantung pada jenis tanaman dan respon yang diinginkan. Ada kultur yang membutuhkan waktu pe-nyinaran yang terus menerus, ada yang 14 – 16 jam/hari, ada yang 10 – 12 jam/hari. Rata-rata waktu penyinaran yang efektif adalah 12 – 16 jam/hari.

Suhu ruang kultur diatur pada suhu 25 – 28^o C. Pada suhu yang terlalu dingin, kultur kadang tidak berkembang dengan baik, begitu juga jika suhu ruang kultur terlalu panas, maka jamur dan bakteri akan berkembang biak dengan cepat dan tanaman menjadi layu.

Gambar penampang rak kultur bila memakai lampu SL

Gambar penampang rak kultur bila memakai lampu TL

Ruang stok/media jadi

Ruangan ini berfungsi sebagai ruang untuk menyimpan media tanam yang sudah di autoklaf. Ruang stok sebaiknya dingin dan gelap, serta kebersihannya harus dijaga. Media tanam akan diinkubasi pada ruang ini selama 3 hari sebelum digunakan. Hal ini untuk mengetahui kondisi media tanam apakah steril atau ter-kontaminasi jamur/bakteri. Apabila media terkontaminasi, sebaiknya segera dikeluar-kan dan diautoklaf selama 1 jam pada tekanan 0.14 Mpa.

Denah lengkap ruangan laboratorium kultur jaringan

Ruang Timbang/Bahan Kimia

Ruang ini berisi stok bahan-bahan kimia, timbangan analitik, magnetik stirer dan lemari es. Semua kegiatan penimbangan bahan kimia dan pembuatan larutan stok dilakukan di ruangan ini.

Berikut skema laboratorium kultur jaringan yang mempunyai 5 ruang sesuai dengan tahapan dan fungsinya masing-masing :

Sedangkan pada laboratorium sederhana, ruang tanam, ruang kultur dan ruang stok media dapat digabung menjadi satu ruangan. Sedangkan ruang preparasi /per-siapan dapat digabung dengan ruang bahan kimia (seperti dalam gambar di bawah). Dari 2 ruangan ini, ruang tanam + kultur harus memakai AC. Untuk daerah yang bersuhu dingin, tanpa memakai AC tidak ada masalah.

Denah sederhana ruangan laboratorium kultur jaringan

Apa Itu Kultur Jaringan ?

APA ITU KULTUR JARINGAN ? Kultur jaringan adalah suatu metode untuk mengisolasi bagian dari tanaman seperti protoplasma, sel, sekelompok sel, jaringan dan organ, serta menumbuhkan-nya dalam kondisi aseptik. Sehingga bagian-bagian tersebut dapat memperbanyak diri dan beregenerasi menjadi tanaman utuh kembali.

Pada mulanya, orientasi teknik kultur jaringan hanya pada pembuktian teori totipotensi sel ” bahwa setiap sel mampu berkembang biak”. Kemudian teknik kultur jaringan berkembang menjadi sarana penelitian di bidang fisiologi tanaman dan aspek-aspek biokimia tanaman serta industri tanaman. Perbanyakan mikro merupakan contoh yang menarik dari penerapan kultur jaringan , terutama untuk beberapa jenis tanaman yang biasa diperbanyak secara vegetatif.

Perbanyakan mikro secara umum dapat diartikan sebagai usaha menumbuh-kan bagian tanaman dalam media aseptik dan diperbanyak hingga menghasilkan tanaman yang sempurna. Tanaman kecil ini kemudian dipindahkan ke media non aseptik (campuran tanah dll). Tujuan pokok penerapan perbanyakan mikro adalah produksi tanaman dalam jumlah besar dalam waktu yang singkat, terutama untuk varietas-varietas unggul yang baru dihasilkan.

Selain untuk perbanyakan mikro, teknik kultur jaringan dapat diterapkan dalam pemuliaan tanaman untuk mempercepat pencapaian tujuan dan membantu jika cara-cara konvensional menemui rintangan alamiah. Melalui teknik kultur jaringan dapat dilakukan manipulasi sebagai berikut :

1.Manipulasi jumlah kromosom melalui bahan kimia atau meregenerasikan jari-ngan tertentu dalam tanaman seperti: endosperma yang memiliki kromosom 3n.

2.Tanaman haploid dan double haploid yang homogeneous melalui kultur anther atau mikrospora.

3.Hibridisasi somatik melalui teknik fusi protoplasma.

4.Transfer DNA atau organel untuk memperoleh sifat tertentu. Kultur jaringan sudah diakui sebagai metode baru dalam perbanyakan tanaman.

Tanaman yang pertama berhasil diperbanyak secara besar-besaran melalui kultur jaringan adalah anggrek. Menyusul berbagai tanaman hias dan tanaman hortikultura lainnya, yang terakhir adalah perbanyakan tanaman kehutanan. Jenis tanaman yang secara ekonomi menguntungkan untuk diperbanyak secara kultur jaringan sudah banyak.

Namun harus diakui bahwa ada beberapa tanaman yang tidak menguntungkan bila dikembangkan dengan kultur jaringan. Misal-nya; kecepatan multiplikasinya rendah, terlalu banyak langkah untuk mencapai tanaman sempurna atau terlalu tinggi tingkat penyimpangan genetiknya.

Pada prinsipnya, perbanyakan melalui kultur jaringan sangat perlu dalam tanaman-tanaman yang ;
1.Persentase perkecambahan biji rendah.
2.Tanaman hibrida yang berasal dari tetua yang tidak menunjukkan male sterility. 3.Hibrida-hibrida yang unik.
4.Perbanyakan pohon-pohon elite.
5.Tanaman yang selalu diperbanyak secara vegetatif; seperti kentang, pisang, strawberry dsb.

Kultur jaringan (tissue culture) sampai sekarang digunakan sebagai suatu istilah umum yang meliputi pertumbuhan kultur secara aseptik dalam wadah yang umumnya tembus cahaya. Sering kali kultur aseptik disebut juga kultur in vitro yang arti sebenarnya; kultur di dalam gelas.

Dalam pelaksanaannya, ditemui pembagian kultur sebagai berikut:
1.Kultur organ,
merupakan kultur yang diinisiasi dari bagian-bagian tanaman seperti: ujung akar, pucuk aksilar, ujung pucuk (meristem dengan beberapa primordia daun) dan embrio sebagai bagian dari biji.

2.Kultur kalus,
merupakan kultur sekumpulan sel yang tidak terorganisir, hanya sel-sel perenkhima yang berasal dari berbagai bahan awal.

3.Kultur suspensi,
adalah kultur sel bebas atau agregat sel kecil dalam media cair dengan pengocokan. Pada umumnya kultur suspensi diinisiasi dari kalus.

4.Kultur protoplasma,
yaitu sel-sel muda yang diinisiasi dalam media cair kemudian dihilangkan dinding selnya dengan menggunakan enzim. Protoplasma kemudian dibiarkan membelah diri dan membentuk dinding kembali pada media padat. Kultur protoplasma digunakan untuk hibridisasi somatik (fusi dua protoplasma).

5.Kultur haploid (kultur mikrospora/kultur anther),
adalah kultur yang berasal dari bagian reproduktif tanaman yaitu; kepala sari atau tepung sarinya. Diharapkan yang tumbuh dan beregenerasi adalah tepung sari sehingga diperoleh kultur yang haploid. Apabila secara khusus yang dipakai sebagai bahan awal adalah tepung sari, maka kultur sering disebut kultur mikrospora. Kultur anther adalah kultur yang diinisiasi dari seluruh kepala sari.

Bagian dari tanaman yang digunakan sebagai bahan untuk inisiasi suatu kultur disebut eksplan. Sedangkan inisiasi adalah kegiatan sterilisasi eksplan yang dari lapang. Pemindahan kultur ke media lain baik pada media yang sama atau berbeda disebut subkultur. Bahan yang diambil pada setiap subkultur disebut sebagai inokulum.

Eksplan yang ditanam pada media tumbuh yang tepat dapat beregenerasi melalui proses yang disebut organogenesis atau embriogenesis. Organogenesis artinya proses terbentuknya organ-organ, seperti; pucuk dan akar. Pucuk yang ter-bentuk pada tempat yang bukan jaringan asal yang biasa disebut pucuk adventif. Contoh pucuk adventif adalah pucuk yang terbentuk dari kalus, pucuk yang terbentuk dari hipokotil, serta pucuk yang terbentuk dari kotiledon akar.

Sedangkan embriogenesis ialah; proses terbentuknya embrio somatik. Embrio somatik adalah embrio yang bukan berasal dari zigot, tetapi dari sel biasa dari tubuh tanaman. Apabila embrio terbentuk langsung dari kultur anther atau mikrospora, prosesnya disebut androgenesis. Proses pembentukan embrio dari ovari yang belum mengalami fertilisasi di-sebut gynogenesis.

Tanaman lengkap hasil regenerasi dalam kultur jaringan disebut plantlet. Planlet sebelum dipindahkan langsung ke lapangan mengalami suatu proses adaptasi yang disebut masa aklimatisasi. Pucuk-pucuk yang terbentuk dari jaringan kalus, terutama yang sudah mengalami subkultur dapat bervariasi. Variasi-variasi ini disebut variasi somaklonal. Penyebab variasi ini belum diketahui dengan pasti. Ada kemungkinan variasi ini suda

h ada dalam eksplan asal karena sifat kromosom mosaic dalam sel-sel somatik ataupun terjadi akibat lingkungan dalam kultur.